На заседании Президиума Российской Академии наук, состоявшемся на прошлой неделе, член-корреспондент РАН Алексей Томилин представил доклад «Фундаментальные основы клеточных технологий и их применение в регенеративной медицине», информирует «Тихоокеанская Россия», ТоРосс.
Плюрипотентные стволовые клетки, которым был посвящён доклад заведующего лабораторией Института цитологии РАН Алексея Николаевича Томилина, выдвинулись на передний край клеточной биологии и, возможно, всей биомедицины в связи с широчайшими возможностями применения этих клеток для моделирования заболеваний и тканезаместительной терапии у человека. Уникальной особенностью этих клеток является способность к cамоподдержанию и дифференцировки во все клеточные типы тканей взрослого организма (за исключением двух внезародышевых клеточных типов — трофэктодермы и первичной эндодермы).
Данное направление биологии получило развитие с открытия в 1981 году эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши, являющихся уже на протяжении 25 лет не только ценным объектом исследования молекулярной механизмов поддержания плюрипотентности, но также и незаменимым инструментом для изучения функции генов методом генного нокаута. Несмотря на значительные усилия, ЭС клетки человека были получены только в 1999 году (Джеймс Томсон), что обозначило перспективы их применения в тканезаместительной терапии у человека. Существенным недостатком этих клеток явилось их отсутствие во взрослом организме. Единственным аллогенным (то есть чаще всего иммунонесовместимым) источником являлись пред-имплантационные эмбрионы человека, получаемых либо путём экстракорпорального оплодотворения, либо же таковые, получаемые посредством переноса соматических ядер от потенциального реципиента в ооцит для дальнейшего получения из развившихся зародышей аутологичных (то есть уже иммуносоместимых) ЭС клеток. Обе процедуры являются дорогостоящими, неэффективными и сомнительными с точки зрения этики. Таким образом, к началу 2000-х годов встал вопрос о получении плюрипотентных стволовых клеток из соматических клеток, что устранило бы моменты как этического, так и практического плана, присущие ЭС клеткам. Ряд предшествующих экспериментальных наблюдений, таких как клонирования овцы Долли Китом Кэмбелом и Яном Вильмутом, а также опыты по слиянию ЭС и соматических клеток (Олег Серов, Остин Смит) доказали принципиальную возможность репрограммирования соматических ядер млекопитающих в плюрипотентное состояние. Несколько исследовательских групп, поверивших в возможность такого репрограммирования при помощи форсированной генной экспрессии, в том числе и группа, возглавляемая Алексеем Томилиным (в то время — в Институте им. Макса Планка в Германии), трудились на этой ниве, придумывая хитроумные системы скрининга факторов репрограммирования и селекции на плюрипотентность. Финиш этой гонки первым преодолел Шиния Яманака, который путём простого перебора 24 факторов, специфичеких для ЭСклеток мыши, вывел минимальную комбинацию транскрипционных факторов, необходимых и достаточных для индукции плюрипотентности в фибробластах мыши: Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (так называемый «коктейль Яманаки»). Полученные в результате репрограммирования клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми (иПС от англ. iPS) клетками, обладали практически неотличимыми от ЭС-клеток характеристиками.
С момента открытия индуцированной плюрипотентности, отмеченной в 2012 году Нобелевской премией, прошло 9 лет, в свет вышло более 10 тысяч статей, описывающих альтернативные комбинации транскрипционных факторов, новые способы получения иПС клеток у разных видов, исследующие молекулярные механизмы клеточного репрограммирования, предлагающих различные способы доставки факторов репрограммирования, использующих различные исходные соматические клеточные типы… Несомненно, открытие индуцированной плюрипотентности являются прорывом в биомедицине. Уже сейчас очевидна незаменимость иПС клеток как при создании in vitro моделей широкого спектра заболеваний человека (так называемых «болезней в чашке Петри»), так и при in vitro скрининге лекарственных препаратов для лечения этих патологий. Ещё более важной стороной иПС клеток является заложенный в них потенциал для тканезаместительной терапии у человека.
Член-корреспондент РАН Алексей Томилин доложил участникам заседания о результатах 20-летних исследований в области плюрипотентных стволовых клеток. Заметная доля этих исследований посвящена центральному регулятору клеточной плюрипотентности, POU-доменному белку Oct4, абсолютно необходимому как для поддержания, так и для индукции плюрипотентности (Oct4 является единственным незаменимым компонентом «коктейля Яманаки»). В ходе проведённых А. Н. Томилиным и его коллегами исследований установлена его биологическая роль в первичных половых клетках и взрослых стволовых клетках млекопитающих, изучены фундаментальные аспекты связи структуры альтернативных димеров POU-доменных транскрипционных факторов и их функции в регуляции транскрипции генов; установлена ключевая роль гомеодоменного белка Cdx2 в трофобластной дифференцировке ЭС клеток млекопитающих; исследованы молекулярные механизмы работы Oct4, выявлен новый класс транскрипционных модуляторов функции белка Oct4, белков семейства PIAS, регулирующих транскрипционную активность и стабильность белка Oct4; предложен новый методический подход к тканеспецифическому генному манипулированию, который может быть применён при лечении плацентарной недостаточности человека; предложен новый способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы, открывающий перспективу проведения генного нокаута, а также отработки подходов к тканезамещению на этой удобной животной модели.
В докладе также приведены текущие проекты и результаты фундаментального характера, недавно полученные в лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток Института цитологии РАН в Санкт-Петербурге, которую возглавляет член-корреспондент РАН Алексей Томилин. Так, посредством изучения одного их регуляторных участков гена Oct4 выявлено новое семейство транскрипционных регуляторов плюрипотентности. В лаборатории также исследуется роль HMG-B1/2 и линкерного гистона H1 в индукции и поддержании клеточной плюрипотентности. В ходе исследований, проведённых совместно с лабораторией Gary K. Owens, выявлена функция гена Oct4 в развитии патологии атеросклеротической бляшки (манускрипт после доделки повторно направлен в Nature Medicine). Результат не только меняет представления об Oct4 как о ключевом регуляторе клеточной пластичности, но и выдвигает его на передний план как атеропротектора, что может оказать существенное влияние на развитие подходов к лечению кардио-васкулярных заболеваний человека.
Заметная доля исследований лаборатории А.Н.Томилина посвящена проектам прикладного толка. Пока ещё нерешённой проблемой, стоящей на пути к использованию ЭСК и иПСК клеток в клинической практике, является туморогенность — неотъемлемое свойство этих клеток. Так, на мышах было показано, что введение ЭС и иПС клеток реципиентам способно приводить к возникновению тератом — быстрорастущих опухолей, содержащих разнообразные клеточные типы всех трёх зародышевых листков. С другой стороны, существующие способы направленной дифференцировки ЭС и иПС клеток in vitro позволяют получить весьма гетерогенные популяции, в которых практически всегда присутствуют остаточные недифференцированные ЭС и иПС клетки, способные при трансплантациях давать начало тератомам. В лаборатории разработана технология генетической сенсибилизации, включающая введение в геном специальной суицидальной кассеты под контролем ЭС/иПС-специфичеcкого регуляторного элемента гена Oct4, которая позволяет решать означенную проблему. Предложенный подход, однако, ассоциирован с риском злокачественного перерождения клеток за счет инсерционного мутагенеза, а также с возможностью спонтанного эпигенетического глушения этой кассеты при долговременном отсутствии позитивной селекции (как это может иметь место после трансплантации), приводящей к утрате контроля за тератогенностью. Решение этой проблемы было недавно найдено в сотрудничестве в Владимиром Ларионовым (NCI, NIH) посредством использования нового поколения синтетических искусственных хромосом человека альфоидного типа (alphoidTetO-ИХЧ) — митотически стабильных, не интегрирующих в геном автономно реплицирующихся векторов с практически неограниченной ёмкости. Для иллюстрации подхода в лаборатории впервые осуществлён перенос alphoidTetO-ИХЧ в ЭС клетки мыши, показаны стабильное поддержание и экспрессия синтетической хромосомы альфоидного типа в этих клетках и их дифференцированных потомках в составе тератом и химерных животных. Результаты открывают широкие возможности для генотерапии и тканезаместительной терапии на основе alphoid-ИХ, на чем сконцентрированы дальнейшие усилия лаборатории.
Алексей Томилин в своём докладе затронул важную тему, касающуюся возможности вхождения России в международную некоммерческую организацию Global Alliance for iPSC Therapies (GAiT), чьей главной задачей является создании международного «Гаплобанка» — глобального ресурса HLA-типированных гомозиготных (HLA-A, HLA-B и HLA-DR) и специфических для каждой из стран-участниц линий иПС клеток, полученных по стандартам GMP и прошедших по вырабатываемым GAiT стандартам контроля качества. Среди прочих ключевыми инициаторами создания GAiT являлись упомянутые ранее в докладе «отец» Долли Ян Вильмут и первоокрыватель иПС клеток Нобелевский лауреат Шиния Яманака; по их мнению создание «Гаплобанка» является менее затратным и перспективным подходом нежели получения иПС линий (в GMP условиях) для каждого индивидуального пациента. На Институт цитологии РАН возложена роль представлять Россию в GAiT, для чего член-корреспондент РАН Алексей Томилин принял участие в собраниях GAiT в Нью-Йорке и в Стокгольме в 2015 году; в настоящее время Институт цитологии РАН участвует в организации следующего собрания GAiT в Санкт-Петербурге, которое состоится в апреле 2016 года. Также, для ознакомления со стандартами GMP представители Института цитологии РАН посетили в 2015 году компанию I-STEM (Genopole, Париж) — одного из ключевых участников GAiT.
В России есть несколько институтов, которые понимают и владеют технологией получения иПС клеток, и эти лаборатории смогли бы участвовать в создании российской части «Гаплобанка». Обязательным условием успешной реализации таких планов является наличие и доступ к GMP лабораториям. В Институте цитологии РАН, например, GMP лаборатория в настоящее время создается, уже идентифицированы два гомозиготных по HLA-A, HLA-B и HLA-DR донора, из которых будут получены линии иПС клеток по протоколам максимально приближенным к тем, которые будут затем использованы в создаваемой GMP лаборатории. Создание и криобанкирование 2-3десятков GMP-линий иПС клеток (по нашим оценкам именно такое число необходимо для покрытия большей части разнообразия HLA-типов, специфических для популяции России), однако, невозможно без Государственной программы и финансовой поддержки. Также необходим доступ к Российским реестрам HLA-типированного костного мозга и пуповинной крови.
Подытожив эту часть доклада, Алексей Томилин отметил, что участие в создании российской части международного «Гаплобанка» позволит ей, во-первых, получить доступ к иПС клеткам, малораспространённым на её территории HLA-типов, и, во-вторых, позволит России быть на переднем крае этого прорывного направления биомедицины, что, без всякого сомнения, сулит здоровью её населения огромные выгоды.